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Insectherin - Produktion von Statherinen in Insektenzellen

Unser Speichel enthält natürliche Proteine, die einer Zahnstein- und Biofilmbildung entgegenwirken können. Ein vielversprechendes Protein ist Statherin. Wir wollen ein biotechnologisches System nutzen, um dieses kostengünstig und nachhaltig zu produzieren und in Hinblick auf potenziell präventiven Eigenschaften zu analysieren.

Merlin Krause, Kristina Worch, Antje Burse (ab Juli 2025)
REAHLIZE-gefördertes Projekt

Etablierung der Immunfluoreszenz-Detektion eines GLUT6-ähnlichen Transportproteins in Insektenzellen

Die Etablierung eines robusten Immunfluoreszenzfärbeprotokolls ermöglicht die Analyse der Expression und Verteilung von Membrantransportern in Sf9-Zellen. Darüber hinaus können die in diesem Projekt entwickelten Methoden für die Analyse anderer mittels BEVS produzierten Proteine genutzt werden, was der Grundlagenforschung sowie anwendungsorientierten biotechnologischen Entwicklungen zugutekommt.

Upscaling Baculovirus-vermittelter Proteinproduktion

Das Upscaling der Kultivierung sowie Proteinproduktion vom Labor- in den Reaktormaßstab ermöglicht die Expression großer Mengen an Zielprotein. Eine Herausforderung dabei ist die Bildung von Schaum, die sich negativ auf das Zellwachstum, die Proteinausbeute und die Prozesskontrolle auswirkt. Wir konnten zeigen, dass sich antifoam agents positiv auf das Wachstum von Sf9-Zellen auswirken und darüber hinaus die Proteinproduktion erhöhen können.

Optimierung Insektenzellkultivierung

Wir versuchen kontinuierlich neue Strategien zur Verbesserung der Effizienz und Reproduzierbarkeit bei der Kultivierung von Sf9-Zellen zu etablieren. Ein Fokus lag dabei auf der Veränderung der Oberflächeneigenschaften von Glas-Kultivierungsgefäße. Wir konnten zeigen, dass die Silanisierung positive Effekte auf das Zellwachstum, die Viabilität und die experimentelle Reproduzierbarkeit im kleinen Maßstab hat, da unerwünschte Zelladhäsion und Aggregation minimiert werden.

Etablierung eines mCherry-Reportersystems

Zur mikroskopischen Kontrolle Baculovirus-vermittelter Proteinexpression wurde ein Reportersystem mit dem fluoreszierenden mCherry etabliert. Dabei entstanden mehrere Konstrukte, sowohl für die Co-Expression von mCherry mit Zielproteinen als auch für die Expression von mCherry-Fusionsproteinen. Mit dem System konnte erfolgreich ein Fusionskonstrukt aus mCherry und einem membranständigen Protein hergestellt werden. Dadurch wird die gezielte Untersuchung der Lokalisation und Expression in Insektenzellkulturen ermöglicht.

Herstellung und funktionelle Charakterisierung eines integralen Transportproteins aus der SLC2-Familie

Membrantransportproteine sind entscheidend für die Aufnahme und Verteilung von Molekülen in Zellen und Organismen. Die Etablierung einer stabilen Plattform für die Herstellung dieser schwer-exprimierbaren Proteine ermöglicht die Analyse ihrer biologischen Eigenschaften sowie Funktionalität und hilft dabei potenzielle biotechnologische und medizinische Anwendungen auszumachen. Innerhalb dieses Projektes soll daher ein Glucose (GLUT)-Transportprotein aus der Familie der solute carrier (SLC) hergestellt werden.

Etablierung verschiedener Methoden der Virustiter-Quantifizierung

Für Infektionsverlauf und Produktausbeute ist die Multiplicity of Infection (MOI) von zentraler Bedeutung. Eine zu niedrige MOI kann zu einer unvollständigen Infektion führen, während eine zu hohe MOI ein vorzeitiges Absterben der Zellen zur Folge haben kann. Eine präzise Quantifizierung der Viruskonzentration zur Berechnung der MOI ist daher essenziell. In diesem Zusammenhang wurde eine mCherry- sowie GP64-basierte qPCR, ein zuverlässiger Plaque-Assay sowie ein zellgrößenbasierter Assay etabliert.

Optimierung der Transfektion und Infektion von Sf9-Zellen

Die effiziente Transfektion und Infektion sind entscheidend für die Herstellung rekombinanter Proteine mittels BEVS. Durch die gezielte Optimierung dieser Prozesse – sowohl in adhärenten als auch in Suspensionskulturen – lassen sich Virenausbeute, Proteinqualität, Proteinausbeute, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit deutlich verbessern. So können eine definierte Viruszugabe und der richtige Erntezeitpunkt Zellstress minimieren, die Synchronität der Expression fördern und die Proteinexpression erhöhen. Besonders in großvolumigen Suspensionssystemen ist eine präzise Infektionskontrolle essenziell für den erfolgreichen Einsatz des Systems in Forschung und Industrie.

Abgeschlossene Abschlussarbeiten

Optimierung der Transfektion mit PEI in Insektenzellen. Bachelorarbeit (2024)

Optimierung der Kultivierungsbedingungen und PEI-Transfektion von Sf9-Zellen mittels rekombinanter Bacmid-DNA. Bachelorarbeit (2022)

Optimierung der Kultivierung und PEI-Transfektion von Sf9-Zellen in Suspension. Bachelorarbeit (2022)

Baculovirus-basierte Produktion eines SLC2-artigen Membrantransportproteins in Insektenzellen im Labormaßstab. Masterarbeit (2022)

Optimierung der Serum-freien Kultivierung und Transfektion von Sf9-Zellen mit baculoviraler DNA unter Nutzung des mCherry-Reportersystems. Bachelorarbeit (2019)

Optimierung der Infektion von Insektenzellen mit Baculoviren unter Nutzung des mCherry-Reportersystems. Bachelorarbeit (2019)

Etablierung und Upscaling Baculovirus-vermittelter Proteinexpression in Sf9-Zellen. Masterarbeit (2019)