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Insektenzellkultur und Baculovirus-Expressionssystem
Insektenzellkultur und Baculovirus-Expressionssystem
Ein Schwerpunkt unserer Forschungsarbeit liegt in der Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf) Zellen und der rekombinanten Proteinproduktion mithilfe des Baculovirus-Expressionsvektorsystems (BEVS).
Insektenzelllinien, wie die Sf9-Zelllinie gewonnen aus dem Ovarialgewebe von S. frugiperda, stellen eine etablierte Plattform für die Produktion rekombinanter Proteine im Labor- und Industriemaßstab dar. Sie zeichnen sich durch eine einfache Handhabung sowie die Fähigkeit aus, komplexe, posttranslational modifizierte eukaryotische Proteine zu exprimieren. Das BEVS nutzt die hohe Infektiosität und genetische Kapazität von Baculoviren - insbesondere des Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) - zur gezielten Einschleusung und Expression fremder Gene in Insektenzellen. Unter Kontrolle starker viraler Promotoren ermöglicht das System eine effiziente Produktion verschiedenster Proteinformen. Aufgrund seiner Flexibilität, Skalierbarkeit und der Möglichkeit zur Co-Expression mehrerer Gene wird das BEVS breit eingesetzt, u. a. zur Herstellung therapeutischer Proteine, Impfstoffkandidaten, viraler Vektoren und für strukturelle Analysen.
Hier finden Sie die Schwerpunkte aktueller und bisheriger Forschung unserer Arbeitsgruppe.
Optimierung Insektenzellkultivierung
Wir untersuchen Strategien zur Verbesserung der Effizienz und Reproduzierbarkeit der Kultivierung von Sf9-Zellen. Ein Fokus liegt dabei auf der Veränderung der Oberflächeneigenschaften von Glas-Kultivierungsgefäße. Wir konnten zeigen, dass die Silanisierung positive Effekte auf das Zellwachstum, die Viabilität und die experimentelle Reproduzierbarkeit im kleinen Maßstab hat, da unerwünschte Zelladhäsion und Aggregation minimiert werden.
Etablierung verschiedener Methoden der Virustiter-Quantifizierung
Für Infektionsverlauf und Produktausbeute ist die Multiplicity of Infection (MOI) von zentraler Bedeutung. Eine zu niedrige MOI kann zu einer unvollständigen Infektion führen, während eine zu hohe MOI ein vorzeitiges Absterben der Zellen zur Folge haben kann. Eine präzise Quantifizierung der Viruskonzentration zur Berechnung der MOI ist daher essenziell. In diesem Zusammenhang konnten wir ein mCherry- sowie GP64-basierte qPCR, einen zuverlässigen Plaque-Assay sowie einen zellgrößenbasierten Assay etablieren.
Optimierung der Transfektion und Infektion von Sf9-Zellen
Die effiziente Transfektion und Infektion sind entscheidend für die Herstellung rekombinanter Proteine mittels BEVS. Durch die gezielte Optimierung dieser Prozesse – sowohl in adhärenten als auch in Suspensionskulturen – lassen sich Virenausbeute, Proteinqualität, Produktausbeute, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit deutlich verbessern. So können eine definierte Viruszugabe und der richtige Erntezeitpunkt Zellstress minimieren, die Synchronität der Expression fördern und die Proteinexpression erhöhen. Besonders in großvolumigen Suspensionssystemen ist eine präzise Infektionskontrolle essenziell für den erfolgreichen Einsatz des Systems in Forschung und Industrie.
Herstellung und funktionelle Charakterisierung eines integralen Transportproteins aus der SLC2-Familie
Im Rahmen einer Doktorarbeit soll mittels BEVS ein Membrantransportprotein hergestellt und funktionell charakterisiert werden. Transportproteine sind entscheidend für die Aufnahme und Verteilung von Molekülen in Zellen und Organismen. Die Etablierung einer stabilen Plattform für die Herstellung dieser schwer-exprimierbaren Proteine ermöglicht die Analyse ihrer biologischer Eigenschaften sowie Funktionalität und hilft dabei potenzielle biotechnologische und medizinische Anwendungen auszumachen.
Upscaling Baculovirus-vermittelter Proteinproduktion
Das Upscaling der Kultivierung sowie Proteinproduktion vom Labor- in den Reaktormaßstab ermöglicht die Expression großer Mengen an Zielprotein. Eine Herausforderung dabei ist die Bildung von Schaum, die sich negativ auf das Zellwachstum, die Proteinausbeute und die Prozesskontrolle auswirkt. Wir konnten zeigen, dass sich antifoam agents positiv auf das Wachstum von Sf9-Zellen auswirken und darüber hinaus die Proteinproduktion erhöhen können.
Etablierung eines mCherry-Reportersystems
Zur mikroskopischen Kontrolle Baculovirus-vermittelter Proteinexpression wurde ein Reportersystem mit dem fluoreszierenden mCherry etabliert. Dabei entstanden mehrere Konstrukte, sowohl für die Co-Expression von mCherry mit Zielproteinen als auch für die Expression von mCherry-Fusionsproteinen. Das System wurde bereits erfolgreich angewendet, unter anderem für die Fusion von mCherry an ein membranständiges Protein, und ermöglicht so die gezielte Untersuchung von Lokalisation und Expression in Insektenzellkulturen.
Abgeschlossene Abschlussarbeiten und Studentische Forschungsprojekte